Сочетание антибиотиков: Совместимость лекарственных средств | «Панацея»

Изолят XDR MRSA культивировали в бульоне Мюллера-Хинтона с поправкой на катионы (MHB) в течение 24 часов при 37 ° C. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли методом микроразбавления бульона, как описано Wiegand et al. [22]. Исходные растворы противомикробных агентов были приготовлены путем расчета количества используемого антибиотика: (количество лекарства в каждой таблетке (y)) / 10 мг = (количество активного агента в каждой таблетке) / (количество лекарства, необходимое для производства 10 таблеток). раствор мг / мл (x)).

Среду, содержащую антибиотик, серийно разводили в 96-луночном планшете для создания массива 10-кратных разведений по всему ряду. Лог-фазовую культуру MRSA разводили в MHB для получения разведения бактериальной суспензии 1/50 и инокулировали в 96-луночный планшет. Колонки 11 и 12 сохраняли как отрицательный и положительный контроль соответственно. Планшеты инкубировали в течение 24 часов при 37 ° C. Лунки, не показавшие видимого помутнения через 24 ч, пересевали на агаре для подсчета колоний. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) считалась самой низкой концентрацией, подавляющей 99% роста бактерий.Каждый эксперимент проводился в двух экземплярах. Синергетические комбинации определяли методом фракционного индекса ингибирующей концентрации (FICI) [23–26]. Расчет FICI включает в себя МИК противомикробных агентов в комбинации, деленную на МИК только агентов для определения взаимодействий с антибиотиками, как показано в следующей формуле: при этом FICI ≤0,5 интерпретируется как «синергетический», FICI = 1–4,0 считается «безразличным». , »И FICI> 4.0 было определено как« антагонистическое ».

Для дальнейшего анализа были выбраны пять высоко синергетических комбинаций против изолята MRSA (LR-2).Критерии выбора требовали, чтобы антибиотики в комбинации принадлежали к более низкому поколению с простым механизмом действия и низкими значениями FICI. Чтобы дополнительно подтвердить синергетический механизм действия, тесты Time-Kill были выполнены для выбранных комбинаций в соответствии с ранее описанным протоколом [27] (Рисунок 3). Вкратце, MHB инокулировали тестируемым организмом и инкубировали до фазы midlog. Аликвоты, содержащие комбинацию антибиотиков (комбинацию из двух или трех препаратов) и тестируемый MRSA при плотности 10 ⁶ КОЕ, инкубировали при 37 ° C.В моменты времени 0 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч и 8 ч инокулят извлекали, серийно разбавляли от 10 ³ до 10 ⁷ , и 100 мкл мкл каждого разведения высевали на питательное вещество. агаровой среде и инкубировали при оптимальных условиях роста S. aureus для определения количества колоний [27]. Кинетика убийства была интерпретирована как «синергетическая», когда наблюдалось снижение роста колониеобразующих единиц (КОЕ) на ≥2-log10 через 24 часа с комбинацией антибиотиков по сравнению с одним наиболее активным лекарственным средством, и «индифферентной», когда было снижение <2-log10. наблюдаемый.

Синергетические комбинации лекарственных средств были затем протестированы на других случайно выбранных метициллин-устойчивых изолятах S. aureus , и их значения MIC и FICI были определены для подтверждения синергизма комбинации лекарственных средств.

Все анализы проводились в двух экземплярах, и средние значения MIC были рассчитаны вместе со стандартными отклонениями. Значения FICI рассчитывались из средних значений MIC, полученных в индивидуальных и комбинированных анализах. Стандартное отклонение представлено в виде графиков на полосах погрешностей.

3. Результаты

Результаты, полученные с помощью метода дисковой диффузии Кирби-Бауэра на изоляте MRSA (LR-2), показали полную устойчивость к пенициллину, цефалоспорину, фторхинолонам, аминогликозидам и гликопептидам, а также частичную устойчивость к карбапенему, тетрациклину и некоторым другим веществам. агенты. Поэтому изолят MRSA (LR-2) был классифицирован как XDR [28]. Индивидуальные анализы МИК показали нечувствительность ко всем антибиотикам из Таблицы 1, за исключением имипенема (МИК = 4 мкМ мкг / мл).Двойные и тройные комбинации антибиотиков из различных подклассов были протестированы против MRSA LR-2, чтобы определить комбинации, которые были синергическими при одновременном введении. На рисунке 4 показаны взаимодействия между антибиотиками, указывающие на синергетические или безразличные отношения.

Все попарные комбинации цефалоспорина с аминогликозидами или карбапенемом не показали синергетического взаимодействия. Однако при сочетании с фторхинолонами наблюдалась некоторая синергия, особенно с моксифлоксацином (MOX / RAD FICI = 0.140; MOX / CXM FICI = 0,265; MOX / CAZ FICI = 0,140; MOX / CTX FICI = 0,265) (рисунок 1 (б)). Следует отметить, что моксифлоксацин является антибиотиком более высокого поколения, чем левофлоксацин [29]. Интересная парная синергическая комбинация цефалоспорина и фторхинолона с низким FICI (0,281) наблюдалась между CAZ / LVX (оба антибиотика более низкого поколения) (рисунок 1 (c)). Все двойные комбинации карбапенема с антибиотиками оказались безуспешными, за исключением комбинации с фторхинолонами. Меропенем показал синергизм с фторхинолонами более высокого поколения (спарфлоксацин и моксифлоксацин с FICI 0.132 и 0,256 соответственно) (рис. 1 (d)), а комбинация фторхинолонов и имипенема показала полностью синергетическое взаимодействие (FICI = 0,126) (рис. 1 (e)). Все попарные комбинации с аминогликозидами были безразличны.

Тройная комбинация амоксициллина / клавулановой кислоты с цефалоспорином дала специфический результат, когда наблюдалась синергия с цефрадином (цефалоспорин поколения 1 ^st ) со значением FICI 0,281 (рис. 2 (b)). Это открытие было интересным, потому что в случае успеха в дальнейших экспериментах неэффективный антибиотик более низкого поколения [30] может быть снова использован.Чувствительность наблюдалась при сочетании амоксициллина / клавулановой кислоты с фторхинолонами (FICI 0,25) (Рисунок 2 (c)) и аминогликозидами (FICI = 0,125) (Рисунок 2 (d)). Тройные комбинации пиперациллина / тазобактама с моксифлоксацином показали синергизм (FICI = 0,281) (рисунок 2 (e)), а также с аминогликозидами, а именно тобрамицином (FICI = 0,281) и фосфомицином (FICI = 0,281) (рисунок 2 (f)), Комбинация пиперациллина / тазобактама и меропенема также показала синергизм (FICI = 0,375).

Комбинации, выбранные для дальнейшего тестирования, включали левофлоксацин-цефтазидим; амоксициллин / клавулановая кислота-тобрамицин; амоксициллин / клавулановая кислота-цефрадин; амоксициллин / клавулановая кислота-офлоксацин; и пиперациллин / тазобактам-тобрамицин.Комбинация левофлоксацина с цефалоспорином была выбрана вместо комбинации моксифлоксацина, поскольку это глюорохинолон более низкого поколения. Амоксициллин / клавулановая кислота и цефрадин были выбраны потому, что оба антибиотика, кроме ингибиторов, относятся к более низкому поколению. Амоксициллин / клавулановая кислота показала значения FICI ниже 0,5 с фторхинолонами и аминогликозидами, поэтому была выбрана одна комбинация из каждой группы. Офлоксацин в комбинации с амоксициллином / клавулановой кислотой попал в этот список, потому что это аминогликозид самого низкого поколения.Тем не менее, тобрамицин не является аминогликозидом низкого поколения, но показал хороший потенциал с другими комбинациями ингибиторов пенициллина- β -лактама. Следовательно, был выбран тобрамицин в сочетании с амоксициллином / клавулановой кислотой и с пиперациллин-тазобактамом.

Кинетика Time-Kill демонстрирует 8-кратное снижение роста по сравнению с одним наиболее активным лекарственным средством, что означает наличие синергетической связи между левофлоксацин-цефтазидимом; амоксициллин / клавулановая кислота-тобрамицин; и пиперациллин-тазобактам-тобрамицин (Рисунки 3 (a) –3 (e)).Бактерицидный эффект наблюдался в течение 8 часов инкубации во всех трех комбинациях.

Комбинация, показывающая снижение> 2-log10 при тестировании на других случайно выбранных изолятах MRSA, комбинация левофлоксацин-цефтазидим, была наиболее успешной комбинацией, поскольку побочная чувствительность наблюдалась у 80% изолятов MRSA. И амоксициллин / клавулановая кислота-тобрамицин; Комбинация пиперациллин-тазобактам-тобрамицин показала синергизм у 50% изолятов MRSA.

4. Обсуждение

Быстрое появление обширной лекарственной устойчивости у грамположительных и грамотрицательных бактерий требует выявления новых терапевтических подходов.Использование моноантибиотических терапевтических подходов обеспечило давление отбора для развития резистентности. С истощающимся арсеналом антибиотиков и пробелом в успешной разработке альтернативных терапевтических средств определение синергетической комбинации доступных в настоящее время антибиотиков могло бы стать эффективной альтернативой сдерживанию тревожного роста устойчивости к антибиотикам [31].

Целью этого исследования было найти комбинации из различных подклассов антибиотиков, которые могут вызывать синергетический эффект в комбинациях против чрезвычайно устойчивых к лекарствам изолятов MRSA.Мы сообщаем, что новая комбинация левофлоксацин-цефтазидим (LVX / CAZ) действует синергетически, оказывая бактерицидное действие на изолят LR-2 XDR MRSA. Ранее было показано, что комбинация фторхинолон-цефалоспорин оказывает синергетический эффект против P. aeruginosa [32].

Наши данные о парных комбинациях показывают, что фторхинолоны (особенно левофлоксацин и моксифлоксацин) очень эффективны в сочетании с цефалоспориновыми и карбапенемными антибиотиками. Хотя монотерапию фторхинолонами рекомендуется минимизировать для лечения S.aureus из-за множественной лекарственной устойчивости [33], это открытие обеспечивает решение для преодоления устойчивости к фторхинолонам у MRSA.

Общие более высокие коэффициенты чувствительности к амоксициллину / клавулановой кислоте в комбинации с другими антибиотиками неудивительны, поскольку имеющиеся данные о противомикробных комбинациях предполагают, что, несмотря на то, что они являются антибиотиком первой линии, бета-лактамные антибиотики в комбинированной терапии имеют решающее значение для лечения упорных S. aureus бактериемия [34].Кроме того, амоксициллин / клавулановая кислота рекомендуется в амальгамациях для преодоления устойчивости к ванкомицину или даптомицину у MRSA [35–37]. Амоксициллин / клавулановая кислота в сочетании с цефрадином, неэффективным антибиотиком более низкого поколения против MRSA [30], представляла собой интересную комбинацию. Этот антибиотик более низкого поколения оказался успешным в исследованиях Time-Kill и показал потенциал для повторного использования в качестве терапевтического агента в комбинации. Хотя трио амоксициллин / клавулановая кислота-тобрамицин продемонстрировало снижение на> 2-log10 для изолята XDR MRSA (LR-2), оно не показало синергетических взаимодействий в других изолятах.Комбинация амоксициллин / клавулановая кислота / фторхинолон (ципрофлоксацин) также доказала свою эффективность ранее для лечения грамотрицательных инфекций протезных суставов [38]. Однако следует отметить, что большинство этих изолятов показали низкие индивидуальные значения MIC для тобрамицина и амоксициллина / клавулановой кислоты, и поэтому значения FICI были в основном «безразличными». Синергизм между комбинацией пиперациллин-тазобактам-меропенем согласуется с выводами PR Gonzales и его коллег [20].

Невозможность подтвердить все синергические комбинации с помощью анализа Time-Kill была ограничением нашего исследования.Из-за этого мы могли упустить из виду определенные комбинации, которые могут дать лучшие результаты, чем те, которые мы проверили. Однако основная цель нашего исследования по тестированию и идентификации комбинаций из различных подклассов, которые взаимодействовали синергетически, принадлежали к более низким поколениям, вызывали бактерицидные эффекты и преодолели резистентность к антибиотикам первого ряда, которые больше нельзя было использовать, была достигнута.

Хотя совместное введение лекарств является многообещающим подходом для смягчения быстрой эволюции устойчивости к антибиотикам, оно также может приводить к неожиданным и нежелательным результатам, как сообщалось ранее [39].Хотя индекс FIC был определен для обеспечения синергетической взаимосвязи между выбранными антибиотиками при использовании в комбинации, дальнейшие исследования могут помочь оптимизировать управление комбинациями антибиотиков.

5. Заключение

Мы сообщаем, что попарная комбинация LVX / CAZ позволяет нам использовать антибиотики первой линии, которые не только оказывают бактерицидное действие против XDR MRSA, но и удовлетворяют потребность во времени, продлевая срок службы существующих антибиотиков. Эта комбинация будет немедленно доступна для использования, поскольку эти препараты уже одобрены FDA.Устойчивость к комбинации антибиотиков, хотя и неизбежна, синергетические исследования, основанные на фактических данных, могут уменьшить возникновение устойчивости. На будущее мы предлагаем провести дальнейшие испытания этих комбинаций in vivo, чтобы определить, являются ли эти амальгамы столь же эффективными in vivo, как и in vitro. Мы также предлагаем провести исследования того, как эти комбинации, в которых белки-мишени антибиотиков, входящих в состав амальгамы, работают синергетически на молекулярном и системном уровнях, чтобы лучше понять.Это поможет прогнозировать лучшие и надежные комбинации в будущем.

Сокращения

Доступность данных

В эту статью включены данные, полученные и проанализированные в ходе этого исследования.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов

SN провела исследование и подготовила рукопись. МА собрал образцы. SV и US провели исследование. Генеральный директор отредактировал и проанализировал исследование. SA и KM разработали, рассмотрели и одобрили исследование.

Благодарности

Эта работа была частично профинансирована Агентством США по международному развитию (3220–29047) Саадиа Андлиб, Гаутам Дантас и Кэри-Энн Д.Бернем. Авторы выражают благодарность больницам третичного уровня за предоставленные бактериальные изоляты. Эта работа была поддержана компанией Pak-US S&T Coop. Программный этап VI.

Почему комбинации антибиотиков с фиксированной дозой обычно не являются хорошей идеей? — 2018 — ReAct

2018-02-28

В статье, опубликованной в Британском журнале клинической фармакологии, МакГеттиган и др. Представляют результаты исследования индийского фармацевтического рынка, на котором было обнаружено 58 фиксированных комбинаций, содержащих как минимум два антибиотика.Комбинации с фиксированными дозами представляют собой фармацевтические продукты, такие как таблетки, мази или суспензии, в которых два или более лекарственных средства объединены в одном продукте. В этом научном центре внимания мы уделяем использованию комбинаций как минимум двух антибиотиков. Теоретически это может показаться хорошей идеей, но на практике это обычно не так.

Фото: Гарет Бентли, Photoshare.

Почему комбинации фиксированных доз?

В целом, есть три причины использовать комбинации антибиотиков:

1. Для повышения эффективности.В основном это связано с поиском синергизма — комбинаций, в которых комбинированный эффект больше, чем дополнительный эффект от одной терапии. Возможно, наиболее успешной комбинацией в этом отношении является Ко-тримоксазол, комбинация триметоприма и сульфаметоксазола.
2. Для расширения спектра. Если возбудитель инфекции неизвестен и есть несколько возможностей выбора, можно использовать комбинацию для расширения спектра. Типичным примером могут служить некоторые мази для местного применения, которые могут содержать один или два антибиотика, противогрибковый и, возможно, противовоспалительный стероид.Идея состоит в том, что любую кожную инфекцию, независимо от причины, можно вылечить одним лекарством.
3. Для снижения риска развития резистентности. Это основная причина лечения туберкулеза (ТБ) и ВИЧ: если вы дадите хотя бы два антибиотика и у патогена разовьется устойчивость к одному из них, другой (-и) все равно сможет убить устойчивый клон.

Опыт других областей инфекционных заболеваний — туберкулез, ВИЧ и малярия

ТБ, ВИЧ и малярия — три основных инфекционных заболевания, имеющих значение для глобального здравоохранения, для которых стандартными рекомендациями для лечения являются заранее определенные комбинации лекарств.Например, для лекарственно-чувствительного туберкулеза рекомендуемым лечением является комбинация из четырех препаратов изониазида, рифампицина, пиразинамида и этамбутола в течение двух месяцев, затем 4 месяца изониазида и рифампицина (2HRZE / 4HR). При туберкулезе с множественной лекарственной устойчивостью рекомендации включают шесть препаратов на 4-6 месяцев, а затем четыре препарата в течение 5 месяцев. Точно так же ВИЧ лечится комбинацией из четырех антиретровирусных препаратов, а малярия лечится комбинацией с артемизином. В этих случаях в рекомендациях Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по лечению рекомендуются комбинации с фиксированными дозами, а некоторые генерики также прошли предварительную квалификацию ВОЗ.

Поскольку периоды лечения несколькими препаратами продолжительны, рекомендации включают использование комбинаций фиксированных доз или пакетов с суточной дозой для улучшения приверженности лечению. Это действительно была очень важная мантра в отношении этих заболеваний: комбинации фиксированных доз жизненно важны для успеха лечения, поскольку они улучшают соблюдение режима лечения и снижают развитие резистентности.

ABR = Устойчивость к антибиотикам
AMR = Устойчивость к противомикробным препаратам

Избегайте комбинаций фиксированных доз в контексте устойчивости к антибиотикам

Кажется интуитивно понятным усвоить урок фиксированных комбинаций ТБ и ВИЧ и применить его к устойчивости к антибиотикам (ABR).Однако в большинстве других областей инфекционных заболеваний эта мантра неприменима, и это одна из причин, по которой устойчивость к противомикробным препаратам (AMR; который включает ВИЧ, малярию и бактериальные инфекции) концептуально отделена от ABR (которая включает бактериальные инфекции, включая туберкулез). ). При других бактериальных инфекциях комбинированная терапия, как правило, не улучшает исход пациентов (на уровне популяции), то есть не увеличивает эффективность и не снижает развитие резистентности.

Хотя рост устойчивости к антибиотикам вызвал большое количество исследований по комбинированной терапии, направленной на преодоление резистентности, снижение развития резистентности или улучшение результатов лечения пациентов, результаты в большинстве своем неоднозначны.Текущие знания подразумевают, что эти виды эффектов сильно зависят от напряжения, а это означает, что каждый случай пациента необходимо оценивать отдельно. Однако это невозможно сделать надежно с помощью существующих методов.

Недостатки комбинаций с фиксированной дозой

Использование комбинаций антибиотиков имеет несколько возможных недостатков:

1. Использование любых лекарств, в том числе антибиотиков, сопряжено с риском побочных реакций. Они могут быть разной степени тяжести, но, помимо индивидуальных рисков, комбинация двух препаратов может вызвать дополнительные риски из-за взаимодействия препаратов.
2. Непредвиденные комбинированные эффекты, такие как антагонизм. Так же, как некоторые комбинации антибиотиков могут вызывать синергетический, усиливающий эффект, другие могут вызывать антагонистические эффекты, которые частично или полностью отменяют действие лекарств.
3. Увеличение общего количества применяемых антибиотиков. Вместо правильной диагностики можно использовать коктейль широкого спектра действия. Это приводит к более серьезному воздействию на микробиом пациентов с повышенным риском, например, диарея, связанная с антибиотиками, а также увеличение числа резистентных бактерий.

Кроме того, антибиотики часто сочетаются с неантибиотическими препаратами, например, в сиропы от кашля. Данные 2009 года из частного сектора здравоохранения в Латинской Америке показали, что 20% продаваемых продуктов представляют собой комбинации фиксированных доз, по крайней мере, с одним антибиотиком. Из продуктов, выявленных в исследовании, у 70% отсутствовали доказательства комбинированного использования.

Международные фармацевтические компании подрывают усилия по борьбе с лекарственной устойчивостью путем производства комбинаций с фиксированными дозами

Из 118 типов КПФ 75 (64%) не получили одобрения от Центральной организации по контролю за лекарственными средствами Индии (CDSCO), США.S. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов или Европейское агентство по лекарственным средствам. Двенадцать транснациональных компаний были ответственны за производство 53 из 118 типов КПФ. К ним относятся Abbott, Astra Zeneca, Baxter, Bayer, Eli Lilly, GlaxoSmithKline (GSK), Merck / MSD, Novartis, Pfizer, Sanofi-Aventis и Wyeth. Из 53 FDC только четыре были одобрены FDA и / или EMA, а 20 не были одобрены CDSCO Индии. Из этих 20 неутвержденных препаратов 18 были произведены Abbott. Роль Abbott в бессмысленном производстве международных фармацевтических компаний в Индии комбинаций с фиксированными дозами не является новой проблемой и широко освещалась репортерами в 2015 году.

Старая проблема со старыми, но все еще эффективными решениями

«Обескураживает и беспокоит то, что, несмотря на неоднократное изложение недостатков фиксированных комбинаций и потенциальных или фактических опасностей их применения, они все еще прописываются в достаточном количестве […], чтобы побудить производителей продолжать их производства и содействия их использованию. Нельзя слишком сильно подчеркнуть, что соблюдение интересов отдельного пациента и наименьший вред наносится, когда назначаются антибиотики, каждый в своей оптимальной дозировке и только для тех инфекций, при которых он специально показан.Их возможные лечебные и жизненно важные свойства также лучше всего сохранятся для других пациентов, если они всегда будут использоваться только таким образом ».

От редакции, Медицинский журнал Новой Англии, 1960.

Комбинации с фиксированными дозами, безусловно, занимают заслуженное место в лечении туберкулеза, ВИЧ и малярии как по эффективности, так и по снижению развития резистентности, и усилия по разработке таких лекарств стоят всех усилий. Однако для других бактериальных инфекций комбинации с фиксированными дозами больше похожи на коробку Пандора, чем на Святой Грааль.Как видно из приведенной выше цитаты, уже 60 лет назад научное сообщество знало о многих проблемах, связанных с комбинациями фиксированных доз. Но все же они преобладают, по-видимому, если нет строгих правил.

Для решения проблемы необходимы действия на нескольких уровнях:

• Страны должны принять и обеспечить соблюдение строгих правил производства и использования комбинаций с фиксированной дозой. Есть примеры хорошо изученных и эффективных комбинаций, таких как триметоприм и сульфаметоксазол.
• Компаниям необходимо осознать, что краткосрочные экономические выгоды в долгосрочной перспективе контрпродуктивны. Кроме того, следует ожидать, что многонациональные компании будут применять самые высокие научные стандарты во всех странах, где они работают.
• Лица, назначающие лекарства, должны помнить о своем основном этическом принципе: Primum non nocere — и осознавать, что использование комбинаций фиксированных доз приносит больше вреда, чем пользы.

Ресурсы

Угрозы глобальному контролю устойчивости к противомикробным препаратам: Централизованно утвержденные и неутвержденные составы антибиотиков, продаваемые в Индии.

Использование антибактериальных комбинаций с фиксированными дозами в частном секторе в восьми странах Латинской Америки в период с 1999 по 2009 год

По мере того, как комбинированные препараты поглощают Индию, американский фармацевтический гигант получает прибыль.

Антибиотики в фиксированной комбинации.

Эффективность антибиотиков изменяется путем комбинирования их друг с другом, лекарствами, не являющимися антибиотиками, или даже с пищевыми добавками — ScienceDaily

Эффективность антибиотиков можно изменить, комбинируя их друг с другом, с лекарствами, не являющимися антибиотиками, или даже с пищевыми добавками.В зависимости от вида бактерий, некоторые комбинации не позволяют антибиотикам работать в полную силу, в то время как другие начинают снижать устойчивость к антибиотикам, сообщают исследователи и сотрудники EMBL в Nature 4 июля.

В ходе первого крупномасштабного скрининга такого рода ученые выявили почти 3000 комбинаций лекарств для трех различных болезнетворных бактерий. Исследованием руководил руководитель группы EMBL Нассос Типас.

Преодоление устойчивости к антибиотикам

Чрезмерное и неправильное употребление антибиотиков привело к широко распространенной устойчивости к антибиотикам.Определенные комбинации лекарств могут помочь в борьбе с бактериальными инфекциями с множественной лекарственной устойчивостью, но они в значительной степени не изучены и редко используются в клиниках. Вот почему в данной статье команда систематически изучала действие антибиотиков в сочетании друг с другом, а также с другими лекарствами и пищевыми добавками у разных видов животных.

Хотя многие из исследованных комбинаций лекарств уменьшали эффект антибиотиков, было более 500 комбинаций лекарств, которые улучшили исход антибиотиков.Выбор этих положительных пар также был протестирован на бактериях с множественной лекарственной устойчивостью, выделенных от инфицированных пациентов больниц, и было обнаружено, что они улучшают эффекты антибиотиков.

Ванилин клинический?

Когда ванилин — соединение, придающее ванили характерный вкус, — был соединен с одним определенным антибиотиком, известным как спектиномицин, он помог антибиотику проникнуть в бактериальные клетки и подавить их рост. Спектиномицин был первоначально разработан в начале 1960-х годов для лечения гонореи, но в настоящее время используется редко из-за устойчивости к нему бактерий.Однако в сочетании с ванилином он может снова стать клинически значимым и использоваться для других болезнетворных микробов. «Из протестированных комбинаций это была одна из наиболее эффективных и многообещающих синергий, которые мы определили», — говорит Ана Рита Брочадо, первый автор статьи и научный сотрудник EMBL. Такие пары могут расширить арсенал оружия в войне против устойчивости к антибиотикам.

Любопытно, однако, что ванилин ослаблял действие многих других типов антибиотиков.В документе показано, что ванилин действует аналогично аспирину, снижая активность многих антибиотиков — хотя его эффекты в клетках человека не тестировались, они, скорее всего, различны.

Согласно Nassos Typas, комбинации препаратов, которые уменьшают действие антибиотиков, также могут быть полезны для здоровья человека. «Антибиотики могут привести к побочным повреждениям и побочным эффектам, потому что они нацелены также на здоровые бактерии. Но эффекты этих комбинаций лекарств очень избирательны и часто влияют только на несколько видов бактерий.В будущем мы могли бы использовать комбинации лекарств, чтобы выборочно предотвращать вредное воздействие антибиотиков на здоровые бактерии. Это также уменьшит развитие устойчивости к антибиотикам, поскольку здоровые бактерии не будут подвергаться давлению, чтобы развить устойчивость к антибиотикам, которая впоследствии может быть передана опасным бактериям ».

Общие принципы

Это исследование является первым в лаборатории широкомасштабным скринингом комбинаций лекарственных препаратов для различных видов бактерий.Используемые соединения уже одобрены для безопасного использования на людях, но исследования на мышах и клинические исследования все еще необходимы для проверки эффективности конкретных комбинаций лекарственных средств на людях. Помимо выявления новых комбинаций лекарств, масштаб этого исследования позволил ученым понять некоторые общие принципы, лежащие в основе лекарственного взаимодействия. Это позволит более рационально выбирать пары лекарств в будущем и может широко применяться в других терапевтических областях.

История Источник:

Материалы предоставлены Европейской лабораторией молекулярной биологии . Примечание. Содержимое можно редактировать по стилю и длине.

Когда наиболее эффективная комбинация антибиотиков приводит к максимальной бактериальной нагрузке: переход «улыбка-хмурый»

Abstract

Традиционно считается, что лучший способ лечить инфекцию с помощью антибиотиков — это «ударить рано и ударить сильно».Предпочтительной стратегией является использование двух антибиотиков, которые производят более сильный эффект в комбинации, чем при использовании любого из них по отдельности. Но обязательно ли оптимальны такие синергетические комбинации? Мы объединяем математическое моделирование, эволюционные эксперименты, полногеномное секвенирование и генетические манипуляции с механизмом резистентности, чтобы продемонстрировать, что применение синергических антибиотиков на практике может быть худшей стратегией, если бактериальный клиренс не будет достигнут после первой фазы лечения. По мере продолжения лечения следует ожидать, что сила синергии антибиотиков будет уменьшаться по мере увеличения частоты резистентных к лекарствам бактерий.Действительно, эффективность антибиотиков экспоненциально снижается в наших пятидневных эволюционных экспериментах. Однако, как предсказывает теория конкурентного высвобождения, устойчивые к лекарствам бактерии размножаются быстрее всего, когда их чувствительные к лекарствам конкуренты устраняются чрезмерно агрессивным лечением. Здесь синергизм вызывает такой сильный отбор на устойчивость, что антагонизм постоянно возникает к 1-му дню, и первоначально наиболее агрессивное лечение создает наибольшую бактериальную нагрузку, на a fortiori больше, чем если бы было дано только одно лекарство.Полное секвенирование генома показывает, что такая быстрая эволюция является результатом амплификации области генома, содержащей четыре механизма устойчивости к лекарствам, включая оперон оттока acrAB . Когда этот оперон удаляется у генетически измененных мутантов и повторяется эволюционный эксперимент, антагонизм не проявляется в течение пяти дней, и синергия с антибиотиками сохраняется дольше. Таким образом, мы пришли к выводу, что, если суперингибирующие дозы не будут достигнуты и поддерживаться до тех пор, пока патоген не будет успешно устранен, синергетические антибиотики могут иметь эффект, противоположный предполагаемому, помогая увеличить нагрузку патогенов там, где и когда лекарства обнаруживаются в субингибирующих концентрациях. .

Сведения об авторе

Мы используем эволюционный подход к проблеме из медицинских наук, пытаясь понять, как наши знания о быстрой бактериальной эволюции должны влиять на то, как мы лечим патогены с помощью антибиотиков. Мы уделяем особое внимание комбинациям различных лекарств, которые целенаправленно используются для создания эффективных методов лечения. Ортодоксальный учебник по медицине и фармакологии гласит, что нужно сильно ударить по патогену с помощью лекарства, а затем продлить лечение, чтобы быть уверенным в том, что он избавится от хозяина; насколько эффективен этот подход, остается предметом дискуссий.Если учебники верны, комбинация двух антибиотиков, которая предотвращает рост бактерий в большей степени, чем если бы использовалось только одно лекарство, должна обеспечить лучшую стратегию лечения. Однако испытать подобные альтернативы сложно in vivo или в клинике, поэтому мы изучили эти идеи в лабораторных условиях, где лечение можно тщательно контролировать, а оптимальную комбинированную терапию легко определять путем измерения плотности бактерий в каждый момент для каждого испытанного лечения. . Изучая концентрации лекарств, при которых можно гарантировать синергизм антибиотиков, мы обнаружили, что продолжительность лечения имеет решающее значение.Наиболее эффективная комбинированная терапия на 1-й день оказалась худшей из всех терапий, которые мы тестировали к середине 2-го дня, а к 5-му дню она почти не подавляла рост бактерий; напротив, лекарства продолжали ухудшать рост при индивидуальном применении.

Образец цитирования: Pena-Miller R, Laehnemann D, Jansen G, Fuentes-Hernandez A, Rosenstiel P, Schulenburg H, et al. (2013) Когда наиболее сильная комбинация антибиотиков выбирает наибольшую бактериальную нагрузку: переход «улыбка-хмурый».PLoS Biol 11 (4): e1001540. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540

Академический редактор: Эндрю Фрейзер Рид, Университет штата Пенсильвания, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 27 июня 2012 г .; Принято к печати: 11 марта 2013 г .; Опубликовано: 23 апреля 2013 г.

Авторские права: © 2013 Pena-Miller et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Структурное финансирование DFG Excellence Clusters Inflamamination at Interfaces and Future Ocean. REB и RPM финансировались за счет грантов EPSRC EP / I00503X / 1 и EP / I018263 / 1 (http://www.epsrc.ac.uk/Pages/default.aspx). AFH финансировался за счет премии CLES Университета Эксетера (без номера гранта). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Наш арсенал противомикробных препаратов может похвастаться широким разнообразием лекарств, и мы продолжаем инвестировать в поиск новых [1]. Тем не менее, бактерии настолько легко адаптируются к окружающей среде, что все антибиотики, используемые в клинической практике, содержат бактерии, которые им сопротивляются [2], [3]. Инфекция Staphylococcus aureus , обнаруженная in vivo , привела к более чем тридцати мутаций de novo после 12-недельной терапии, каждая мутация приводила к увеличению лекарственной устойчивости [4].С таким быстро развивающимся противником и значительным сокращением программ открытия антибиотиков [3], определение принципов оптимизации, которые поддерживают эффективность уже имеющегося у нас репертуара антибиотиков, представляет собой одну из самых серьезных проблем, стоящих перед научным сообществом.

И все же эволюция лекарственной устойчивости была названа «концептуально неинтересной» [5]. Эта точка зрения является результатом предположения о фиксированных сроках: патоген лечится антибиотиками, появляются признаки устойчивости, распространяются среди населения и устраняются.Чем эффективнее лекарство, тем больше отбор по устойчивости и тем быстрее она устраняется. Единственное смягчающее действие, которое мы можем предпринять, — это раннее поражение, сильное поражение и уничтожение чувствительных к лекарствам клеток до того, как они накапливаются, как гласит старый аргумент [6].

Бактерии больше всего страдают от сочетания нескольких лекарственных препаратов. Комбинации, разработанные более 70 лет назад [1], [7], [8], играют ключевую роль в нашей борьбе с микробами [9], вирусами [10] и раком [11]. Комбинации, которые считаются синергическими, когда два препарата воздействуют на патоген намного сильнее, чем каждое лекарство по отдельности, высоко ценятся [1], [12], [13].Действительно, быстрое применение синергических антибиотиков должно, согласно той же логике, быть самым быстрым способом избавления от бактерий.

Чтобы сделать наше обсуждение более точным, мы говорим, что пара бактериостатических антибиотиков с одинаковой эффективностью является синергетической, если 50-50-взвешенная комбинация обоих препаратов подавляет рост больше, чем два лечения одним лекарством при измерении роста бактерий в течение одного дня [8 ], [14] — [16]. (Строго говоря, мы просим это для всех ( θ, (1 − θ )) — комбинаций, где θ — это любое значение от 0 до 100%, а не только 50-50, как показано на рисунке 1.) С этим определением мы можем сформулировать нулевую гипотезу, H ₀ : синергетическая комбинация лекарств также синергетически подавляет рост, если лечение длится дольше, чем дней. Иными словами, если комбинированное лечение 50-50 более эффективно, чем оба монотерапевтических препарата одним лекарством в первый день лечения, оно также должно быть более эффективным в последующие дни, чтобы считаться синергическим.

Профиль взаимодействия лекарств тесно связан с двумя диаграммами «шахматная доска», показанными на (а) и (с).На шахматной доске концентрация обоих лекарств дана по осям x и y , затем по оси z отложено подавление роста бактерий (или плотность популяции или какой-либо другой показатель пригодности). Контур всех концентраций, уменьшающих этот показатель вдвое, представляет собой изоболу , обозначенную здесь IC ₅₀ , а на рисунках (а) и (с) показаны две диаграммы в виде шахматной доски, если смотреть сверху. Базовые концентрации обоих препаратов, которые обеспечивают одинаковый ингибирующий эффект на этой иллюстрации, составляют D ₅₀ и E ₅₀ , θ , а затем параметрируют линию равнодозировки между этими двумя значениями.Мера приспособленности, оцененная по этой линии, показана на (b) и (d), и мы определяем степень взаимодействия на основе этой кривой, это i ( θ ). Мы говорим, что взаимодействие синергетическое , когда пропорция лекарства, которая минимизирует i ( θ ), удовлетворяет 0 < θ <1, как в (b), мы обозначаем результирующее значение как θ _syn . В (d) мы наблюдаем θ _syn = 0 или θ _syn = 1, в этом случае наркотики считаются антагонистическими , поскольку i ( θ ) максимизируется каким-либо лекарством. комбинации и минимизированы монотерапией.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540.g001

Любой тест in vitro на H ₀ требует использования концентраций антибиотиков, которые поддерживают измеримую плотность населения, методы лечения, которые мы можем использовать для test, в результате, обязательно ограничиваются режимом субингибиторного дозирования. Поэтому мы должны задаться вопросом, насколько актуально это исследование для использования антибиотика in vivo , мы утверждаем, что оно актуально по следующим причинам.Взаимодействие с лекарствами часто определяется однодневными шахматными досками и изоболами [17], как показано на рисунке 1, но по самой своей природе шахматные доски дают представление только о взаимодействии внутри субингибиторного режима, поскольку изоболы могут быть рассчитаны только в том случае, если клетки растут. . Более того, во время лечения концентрации лекарств могут снижаться от самых высоких значений до субингибирующих концентраций ([18], рис. 1), что неоднократно происходит при прерывистых режимах дозирования [19], [20]. Различная диффузионная способность малых молекул антибиотиков в разных тканях может создавать существенные неоднородности в концентрации [21], приводя к потенциальной пространственно-временной мозаике отбора на устойчивость [18], [22], в результате чего лечение может снизить нагрузку патогенными микроорганизмами в некоторых, но не во всех органах. [23].Действительно, сама пространственная диффузия создает градиенты концентрации с быстрым суперэкспоненциальным затуханием вдали от точечного источника. Поэтому важно понимать, как комбинации антибиотиков опосредуют резистентность при всех дозировках в рамках этой мозаики, включая субингибиторные, особенно потому, что известно, что резистентность выбирается при очень низких концентрациях, значительно ниже минимальной ингибирующей концентрации [24].

Теперь мы утверждаем, что лечение с наибольшей краткосрочной эффективностью не обязательно приводит к наименьшей плотности бактерий позже.Простая конструкция, учитывающая как зависящий от плотности, так и частотно-зависимый отбор по лекарственной устойчивости, достаточна, чтобы объяснить, почему. Рассмотрим три сценария с двумя наркотиками: «А» и «Б». Бактерия либо не подвергается воздействию антибиотиков, либо заражается только препаратом А (или только препаратом В), либо обрабатывается оптимально синергической комбинацией обоих, как показано на рисунке 2 (а). При безмедикаментозном лечении клетки растут, скажем, до максимальной несущей способности, без отбора устойчивых к лекарствам фенотипов. Синергетическая комбинация оптимально ингибирует чувствительные к лекарству клетки, лучше, чем две монотерапии, и поэтому к концу дня 1 при этом лечении наблюдается самая низкая бактериальная нагрузка из всех.Однако предположим, что некоторые клетки проявляют генетическую или эпигенетическую адаптацию, придающую устойчивость; такие клетки могли даже присутствовать на низких частотах в начале лечения. Сейчас именно в синергетической линии лучше всего проявляются лекарственно-устойчивые фенотипы, поскольку у них меньше конкурентов для внеклеточных метаболитов, необходимых для роста.

Рис. 2. Переход улыбка-хмурый взгляд: словесный аргумент и игрушечная математическая модель.

(a) Синергические препараты подавляют субпопуляции, восприимчивые к лекарствам (желтые клетки), в большей степени, чем терапия с использованием одного лекарства, однако это устраняет конкурентов устойчивых к лекарствам красных клеток, которые растут быстрее, чем желтые клетки, при более слабом синергизме. .Таким образом, большая синергия может увеличить плотность населения. (b) Решение уравнения 1a – b и построение графика зависимости плотности популяции от пропорции наркотиков показывает, что краткосрочная синергетическая комбинация (синий) может максимизировать плотности позже (красный). Красные точки показывают путь оптимальной комбинации, обратите внимание, что эта идеализированная модель симметрична относительно θ = 1/2, но эмпирические данные не будут такими. (c и d) плотности чувствительных к лекарству клеток ( S на вертикальной оси на (c)) и резистантов ( R на вертикальной оси на (d)) показаны в разное время, где, опять же, синяя линия обозначает краткосрочное лечение, а красная линия обозначает более длительное лечение.Стрелка в (c) представляет потерю S , которая происходит из-за наркотика, тогда как стрелка в (d) представляет аналогичную прибыль в R . Для более длительных обработок последнее более чем компенсирует первое, и суммируя красные и синие линии на (b) и (c), соответственно, мы получаем красную и синюю кривые, показывающие плотность популяции, Δ = S + R , в).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540.g002

Чтобы прояснить, как это может возникнуть, представьте себе популяцию бактерий с двумя субпопуляциями, чувствительных к лекарствам и устойчивых клеток, и предположите, что внеклеточные метаболиты одинаково распределяются между растущие клетки.Поскольку рост восприимчивых веществ больше подавляется при большей синергии, больше метаболитов становится доступным для резистентных клеток при таком лечении. Однако устойчивые клетки обязательно растут быстрее, чем восприимчивые клетки, когда присутствуют лекарства, с большей разницей в пригодности при большей синергии. Таким образом, общая плотность популяции может быть увеличена за счет синергизма, даже когда количество присутствующих чувствительных к лекарству клеток уменьшается. Теперь, если резистентные клетки отсутствуют или имеют низкую частоту в начале лечения, воздействие антибиотиков должно быть достаточно продолжительным, чтобы позволить резистентам достичь плотности, сравнимой с чувствительными, и поэтому продолжительность лечения должна быть достаточно большой, чтобы заявить в предыдущем предложении, чтобы быть правдой.Этот процесс показан на Рисунке 2.

Эта идея, известная как «конкурентное высвобождение» [25], была протестирована при лечении малярии in vivo с использованием мышей [5], где было показано, что более высокие концентрации лекарства приводят к более высокой нагрузке паразитами, но конкурентное высвобождение делает новые прогнозы для антибиотиков терапия, в частности, для комбинаций. Во-первых, оптимальная комбинация не является надежной: лучший способ использования пары препаратов зависит от того, как долго длится лечение. Во-вторых, и, как следствие, благоприятное свойство синергии антибиотиков не обязательно устойчиво к адаптациям, которые придают лекарственную устойчивость.Синергия не только со временем угаснет, но и может быть полностью потеряна и заменена антагонизмом, потому что более сильные комбинации парадоксальным образом выбираются для большей бактериальной нагрузки. Таким образом, теория конкурентного выпуска не согласуется с нашей нулевой гипотезой и дает эволюционное обоснование для ее отклонения.

Игрушечная математическая модель полностью отражает вербальный аргумент и показывает, что потерю синергии можно рассматривать как своего рода переломный момент. Представьте себе бактериальную популяцию, состоящую из клеток, чувствительных к обоим антибиотикам, с плотностью S (t) , где t — время.Предположим, что существует полностью устойчивый фенотип, R (t) , и μ — это средняя скорость случайного пуассоновского процесса, с помощью которого чувствительные клетки приобретают устойчивость. Безразмерная переменная θ между нулем и единицей контролирует комбинацию лекарств, а k ( θ ) = 1+ θ (1- θ ) измеряет эффективность каждой комбинации при концентрациях лекарства ( A , B). ) = ( A ₀ θ , B ₀ (1- θ )).Здесь A ₀ и B ₀ — нормализующие концентрации, выбранные таким образом, чтобы каждое лекарство достигло равного ингибирующего эффекта в определенное время. Обратите внимание, что k ( θ ) максимизируется, когда θ = 1/2. Это значение представляет собой комбинированную терапию 50-50, где ( A , B ) = ( A ₀ /2, B ₀ /2).

Игрушечная модель представляет собой следующее уравнение логистического роста, модифицированное с учетом антибиотиков: (1a) (1b) где и R (0) = 0.Поэтому мы начинаем с восприимчивых клеток, но не с резистентных. На рисунке 2 (b) показаны плотности населения, полученные в результате этой модели, Δ _t ( θ ) = S ( θ, t ) + R ( θ, t ), нанесенный на график. как функция θ для возрастающих значений времени t .

На короткое время (уравнение 1a – b) проявляет синергию, потому что плотность подавляется больше всего комбинацией, где θ = 1/2, поэтому график Δ _t ( θ ) имеет выпуклую U-образную форму ‘ улыбка ‘показано синим цветом на рисунке 2 (b).В более позднее время, но только при условии μ > 0, форма профиля плотности изменяется, и теперь плотность составляет наибольшая для комбинации 50-50 и наименьшая для «монотерапии», где θ = 0 и θ = 1. Таким образом, график Δ _t ( θ ) теперь демонстрирует почти вогнутый W-образный «хмурый вид», соответствующий антагонизму, имеющему максимальное значение при θ = 1/2, как показано. красным на рисунке 2 (б). Плотность теперь максимальна, хотя раньше была минимизирована .Мы называем результирующий переход от синергии к антагонизму «переходом улыбка-хмурый взгляд», иногда называя его «инверсией синергии», потому что выпуклый синергетический профиль инвертируется, образуя почти вогнутый антагонистический профиль; это понятие инверсии синергии отличается от представленного в [26].

Если мы установим μ = 0, таким образом предотвращая адаптацию моделируемой популяции к препарату, тогда следует, что Δ _t ( θ ) всегда имеет синергетический профиль.В этом случае комбинация 50-50, представленная значением θ = 1/2, является оптимальной комбинацией для всех времен, поскольку она минимизирует плотность популяции, независимо от продолжительности лечения.

Мы проверили правдивость этих теоретических предсказаний, используя подход эволюционной функциональной геномики, который объединил эволюционные эксперименты с использованием Escherichia coli , геномный анализ, генетические манипуляции с выявленным механизмом устойчивости кандидата и количественное математическое моделирование.Этот подход подчеркивает молекулярный механизм, который вызывает потерю синергии, предсказанную теорией, тогда как теория ссылается на общность эмпирических результатов, которые мы сейчас описываем.

Результаты

Эволюция семейства комбинированных процедур: экспериментальный дизайн

Приведенные выше прогнозы лучше всего проверены in vitro , где лекарственные взаимодействия хорошо изучены и могут строго контролироваться. Поэтому мы культивировали E. coli K12 (MC4100) в течение пяти дней с использованием протокола серийных разведений и шестнадцати различных комбинаций эритромицина (ERY, макролид) и доксициклина (DOX, тетрациклин), двух бактериостатических ингибиторов трансляции с установленная синергия [14].Бактерии сначала культивируют в течение 24 часов в жидкой питательной среде, содержащей антибиотики в концентрациях, описанных ниже, а в конце 24-часового периода случайный образец бактерий переносят с использованием стандартного репликатора для планшетов для инокуляции свежей питательной среды. Этот процесс повторяется, чтобы создать курс лечения на несколько дней.

Мы начали с выбора пары нормализующих, или «базальных», концентраций антибиотиков, D ₅₀ и E ₅₀ , таким образом, чтобы каждая монотерапия только DOX и только ERY давала 50% снижение плотности при измерении через 24 часа по сравнению с контролем без лекарственного средства (базальные концентрации D ₅₀ и E ₅₀ представляют собой значения IC ₅₀ для каждого лекарственного средства).Таким образом, каждое из шестнадцати различных курсов лечения может быть описано одной парой концентраций (2), где θ — относительная пропорция лекарственного средства. При сочетании в соотношении 50-50 в этих дозах, где θ = 1/2, достигается снижение роста бактерий на 90% за 24 часа, что больше, чем снижение на 50%, достигаемое каждой монотерапией (данные на рис. (а) (День 1) поддерживает это). Мы реализовали 14 различных комбинированных процедур и две монотерапии в этих базальных дозах с θ в диапазоне дискретных значений от 0 и 1/15 до 14/15, а затем 1 (19 повторов на лечение; см. Раздел 3.2 в тексте S1).

Рис. 3. Динамика оптимального лечения: чем больше раннее ингибирование, тем быстрее снижается эффективность и, следовательно, выше результирующая плотность бактерий.

(a) Используя показатель ингибирования площади под кривой (AUC), выраженный как процент роста без антибиотиков, комбинация ERY и DOX оптимальна в день 1 (красная линия, ’50-50′), но Монотерапия ERY оптимальна на второй день (после пересечения линий; см. Рисунок 4). Путь трех экстремальных методов лечения показан в виде линий, цветные точки представляют оставшиеся тринадцать процедур с цветовой кодировкой от зеленого (ERY) до синего (DOX).(b) Экспоненциально затухающие данные накладываются на три обработки из (a).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540.g003

Фиксированная пропорция лекарственного средства θ , которая минимизирует плотность бактерий из шестнадцати введенных и определяемых эмпирически путем культивирования бактерий в течение 24 часов, будет обозначена как θ _syn в следующем. Это значение между нулем и единицей обозначает максимальное синергетическое комбинированное лечение, полученное после фиксации базовых концентраций лекарственного средства, как показано на рисунке 1 (b).Оптимальная комбинация, зависящая от времени, будет обозначена θ _opt ( T ) (см. Материалы и методы), и это значение представляет собой комбинацию ERY и DOX, которая минимизирует плотность для обработки длительностью T часов. Из конструкции следует, что θ _opt ( T ) = θ _syn , если T мало, например, менее 24 часов.

После калибровки концентраций D и E так, чтобы каждый препарат имел равный эффект, поэтому на практике θ _син ≈1 / 2, как показано на Рисунке 4 (c), краткосрочным оптимальным лечением является 50- 50 комбинаций ERY и DOX.Как отражение этого, данные дня 1 на рисунке 3 (a) затем показывают снижение роста на 50%, полученное для каждой монотерапии, снижение на 90% для максимально синергетической комбинации 50-50 в дополнение к снижению роста для всех других комбинации, которые мы тестировали. Теперь мы можем проверить нашу нулевую гипотезу, задав вопрос, является ли комбинация препаратов, оптимальная в первый день, 50-50 по дизайну, оптимальной и в последующие дни. pbio.1001540.e001 Уравнение 1 дает четкое предсказание: лучшая терапия в первый день будет худшей позже.

Рис. 4. Профили взаимодействия лекарств являются динамическими.

(a) Степень взаимодействия, I ( T ), определенная в материалах и методах, показана в разное время от 12 до 108 часов: I ( T ) отрицательна для T ≤24 ч, что означает синергию, но положительно для всех T . ≥36 часов, что означает антагонизм (вертикальные столбцы отмечены, 19 повторов). (b) Более точная мера взаимодействия, чем та, которая использовалась в (a), степень взаимодействия, полученная с использованием α -теста, определенного в разделе «Материалы и методы», дает локус мер взаимодействия лекарств как функцию времени.В соответствии с (а), эта мера меняет знак, указывая на изменение взаимодействия около 30 часов (примечание: — α нанесен на график). (c) Переход улыбка-хмурый взгляд напоминает фазовый переход при применении α -теста к i ( θ , T ), полученному из данных плотности MC4100: серая линия показывает оптимальную комбинацию лекарств, которая минимизирует . i ( θ , T ), красная линия показывает максимальную комбинацию. По мере того как профиль лекарственного взаимодействия «инвертируется», краткосрочная оптимальная терапия смещается в течение очень короткого периода и становится наихудшей терапией после примерно 30 часов.(Ось y изменяется от θ = 0 (обозначает ERY-монотерапию) до θ = 1 (для DOX-монотерапии), s.e. показана в виде пары пунктирных линий.)

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540.g004

Переход между улыбкой и хмурым взглядом: эмпирический тест

Данные первого дня демонстрируют синергизм с самой низкой кратковременной плотностью бактерий, обнаруженной для примерно 50-50 комбинаций ERY и DOX, поэтому θ _syn ≈1 / 2, это можно увидеть на Рисунке 5 (показано синим ).Тем не менее, последующая динамика популяции после первого дня приводит к тому, что мы отклоняем H ₀ , поскольку рисунок 5 (красный) показывает, что они согласуются с теорией конкурентного выпуска и демонстрируют переход от улыбки к хмурому лицу до истечения 36 часов, как мы сейчас объясняем.

Рис. 5. Переход «улыбка-хмурый взгляд» в эмпирических данных и смоделированной плотности бактерий.

Показаны эмпирические и смоделированные плотности бактерий (точки и линии, соответственно) для 16 различных пропорций лекарств, обозначенных θ и в диапазоне от 0 (обозначает ERY) до 1 (обозначает DOX) на горизонтальной оси.Плотность популяций, измеренная как оптическая плотность, нанесена на график в зависимости от пропорции лекарственного средства, что показано здесь на панели из шести временных точек с интервалом в 24 часа для каждой синей и красной точки отсчета. Данные были получены с использованием E. coli K12 (MC4100), зараженного эритромицином и доксициклином. Переход улыбка-хмурый взгляд, описанный в тексте, происходит примерно через 30 часов, после чего синергизм лекарственного средства сменяется антагонизмом. Модель предполагает, что отток нескольких лекарств является единственным механизмом резистентности, и интерполирует дискретный набор данных для получения серии непрерывных профилей взаимодействия, как показано.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540.g005

В соответствии с предсказаниями pbio.1001540.e001 Уравнение 1, рисунок 4 (a) показывает, как степень взаимодействия, I ( T ), определенный в материалах и методах, смещается от синергии (где I ( T ) <0; t -test, df = 19, t ≈ −6,13, p <0,0001,) на антагонизм (где I ( T )> 0; т -тест, df = 19, т ≈6.83, p <0,0001) от 12 до 36 часов. После этого степень взаимодействия остается положительной, что означает антагонизм, до конца эксперимента. Это показано более подробно на рисунке 4 (b), где динамика профиля взаимодействия показана на почасовой основе; это показывает, что взаимодействие изменяется примерно через 30 часов.

При более внимательном рассмотрении видимого изменения взаимодействия лекарств на рисунке 5, через 12 ч профиль взаимодействия синергетический ( α -тест, α = 0.61 ± 0,05> 0, df = 13, t ≈11,22, p <10 ⁻⁷ , θ _opt (12 h ) = 0,49 ± 0,01 ≈ θ _син ; описание теста α см. в разделе «Материалы и методы» и в разделе 4.3 в тексте S1), но комбинированные методы лечения, для которых θ ≈2 / 3 (надежно оценено с использованием теста α , описанного в разделе «Материалы и методы как 0,65»). ± 0,04) дают наивысших наблюдаемых плотностей населения к 36 часам.В результате оптимальная комбинация изменилась в течение двух дней с комбинации 50-50 на монотерапию ERY, поскольку профиль взаимодействия теперь антагонистический ( α -тест, α = -0,44 ± 0,14 <0, df = 13 , t ≈ −3,05, p <0,0093, θ _opt (36 h ) ≈0 ≠ θ _syn ; раздел 4.3 в тексте S1).

Эти данные были получены для измерения оптической плотности роста бактерий, но аналогичные результаты получены с использованием других понятий приспособленности.Используя площадь под кривой, измеряющую задержку роста, которая учитывает как размер популяции, так и темпы роста (Раздел 4.2 в тексте S1) Рисунок 3 (a) показывает, что эффективность лекарственного средства приближается к нулю наиболее быстро для примерно 50-50 комбинированных курсов лечения. На том же рисунке показано, что оптимальное лечение в этом отношении также сместилось в сторону монотерапии ERY в течение двух дней. Для полноты, переход улыбка-хмурый вид также наблюдается, если мы используем колониеобразующие единицы для измерения плотности бактериальной популяции (Раздел 7.4 в тексте S1).

В качестве дополнительного теста на потерю синергизма были получены шахматные доски доза-реакция и изоболограммы с использованием бактерий, отобранных в результате высоко синергетической обработки θ ≈8 / 15 в начале первого и пятого дней, оба показаны на рисунке 6. более ранняя шахматная доска соответствует синергизму, тогда как последняя шахматная доска показывает прогрессирующую волну повышенного сопротивления, с синергизмом при более высоких концентрациях лекарственного средства и смешанным взаимодействием, очевидным при более низких концентрациях.На рис. 6 (а, справа) показаны изоболы с ингибированием 60%, которые указывают на супрессивное взаимодействие к 4-му дню, при котором доксициклин снижает ингибирующий эффект эритромицина. Белая изобола 50% ингибирования на Фигуре 6 (b) показывает сдвиг с 1-го на 5-й день, что указывает на повышенную устойчивость популяции как к ERY, так и к DOX (для контроля, антибиотики не разлагаются значительно при хранении при 4 ° C в течение несколько дней см. раздел 3.2 в тексте S1).

Рисунок 6. Таблицы лекарств и изоболограммы.

(a) Эмпирические шахматные доски «доза-реакция» показывают данные о плотности населения на оси z в зависимости от концентрации лекарственного средства на осях x и y. Эти данные были получены путем культивирования E. coli , взятых из высоко синергетической среды 50-50 на первый и пятый дни (обработка 4,8 мкг / мл ERY и 0,08 мкг / мл DOX), они подтверждают известный синергизм на 1 день. и указывает на появление более сложного взаимодействия к 5-му дню. Обратите внимание, что 50% ингибирование по сравнению с контрольной популяцией без лекарственного средства показано белыми блоками; (справа) 70% изобола выделена зеленой линией, что указывает на взаимодействие, при котором одно лекарство подавляет действие другого.(b) Изоболы (линии равного ингибирующего действия) показаны на основе числового фильтра данных из (a) (алгоритм подбора и код описаны в [50]). Черные линии соответствуют изоболам в интервалах 10% ингибирования, самые темные красные области показывают возрастающие концентрации лекарственного средства с ингибированием до 100%, самые темные синие области обозначают ингибирование, наиболее близкое к 0%. Белая область означает 50% ингибирование.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540.g006

Стабилизирующая синергия: геномный прогноз на основе математической модели

Установив быструю потерю оптимальности наиболее синергетического комбинированного лечения, когда последнее становится наихудшим лечением из всех, важно, чтобы мы понимали генетическую основу этого изменения.Поэтому сначала мы провели тест, чтобы определить, была ли повышенная лекарственная устойчивость результатом эпигенетической адаптации (раздел 3.2 в тексте S1).

Пробы каждого из первоначально наиболее синергетического лекарственного лечения и контрольного лечения без лекарственного средства были взяты в конце 5-го дня и культивированы без антибиотиков в течение следующих 24 часов. Затем все полученные популяции подвергались воздействию наиболее синергетической комбинации лекарственных препаратов в течение еще 24 часов. В соответствии с вероятной генетической основой адаптации к лекарственной устойчивости, образцы от краткосрочного синергетического лечения по-прежнему демонстрировали большее ингибирование AUC при измерении по сравнению с контролем без лекарств (знаковый ранговый критерий Вилкоксона, W = 92, N = 10, п. <0.001).

Зная, что такая быстрая адаптация имеет генетическую основу, наша цель состояла в том, чтобы использовать механизм устойчивости и понять, какая функция организма, при соответствующем манипулировании, могла бы поддерживать синергию антибиотиков дольше и, таким образом, гарантировать, что переход от улыбки к хмуриться не произойдет так быстро.

Таким образом, мы провели исследование секвенирования полногенома независимых биологических реплик как монотерапии, так и максимально синергетического лечения, взятых в конце дня 5. Анализ выявил однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в большинстве реплик, модифицирующих физиологию, метаболизм и лекарственную устойчивость. , включая обработки с SNP в marRAB и acrR (см. Таблицу 1, Рисунок 7 и Раздел 5.3 в тексте S1). Действительно, известно, что регулон mar контролирует ряд стресс-ответов у E. coli [27], включая систему оттока нескольких лекарственных препаратов acrAB-tolC [28].

Рис. 7. Графики покрытия подчеркивают подозреваемую дупликацию: увеличение охвата в 2 раза предполагает дупликацию гена.

Область размером 315 Кбайт генома E. coli K12 (MC4100) содержит оперон acrAB и выделена красным. Эта область не дублировалась для лечения без антибиотика («Без лекарства»), она дублировалась для монотерапии (как «ERY», так и «DOX»), но чаще всего дублировалась для комбинированного лечения с наибольшим синергетическим эффектом («50-50» ).Внешнее кольцо (черная линия) указывает положение генома, серые блоки охватывают различные реплики каждой обработки (реплики отмечены буквенной меткой), а самые красные области, скорее всего, были дублированы.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540.g007

Таблица 1. Обзор однонуклеотидных полиморфизмов в геномах E. coli K12 (MC4100), которые развились в течение пяти дней при лечении эритромицином и доксициклином или в комбинации 50-50 обоих.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540.t001

Быстрое повышение устойчивости к антибиотикам может происходить, когда участки генома, содержащие гены устойчивости, дублируются, и для обнаружения таких дупликации [29], [30]. Наш анализ показал, что 90% независимых повторов при наиболее синергетическом комбинированном лечении имели один и тот же дублированный фрагмент размером 315 кб, область, содержащую несколько оттокных насосов, включая acr (таблица 2, раздел 5.4 в тексте S1). Дупликация была обнаружена и при монотерапии, но только в 30–40% случаев (3/10 повторов только для DOX и 2/6 для только ERY).

Таблица 2. Несколько генов связывания с антибиотиками и резистентности обнаружены в геномной области размером 315 т.п.н., наиболее часто дуплицированные при комбинированном лечении 50-50, включая следующие гены и их аннотации.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540.t002

Таким образом, дупликация наблюдалась значительно больше при комбинированном лечении 50-50, чем при монотерапии ERY (точный тест Фишера, P <0.035) и монотерапии DOX (точный тест Фишера, P <0,02). Во всех 14 повторах, где была обнаружена дупликация, она располагалась между положениями 274 201 п.н. и 589 900 п.н. Эта область содержит 293 гена, среди которых 12 генов устойчивости или связывания с антибиотиками, 32 гена-переносчика и 31 ген, связанный с транспозонами (Приложение B в тексте S1). Перекрестная резистентность к антибиотикам, не используемым в протоколе, вероятно, так как три известные системы оттока нескольких лекарств и белки деградации ампициллина кодируются в дублированной области (Раздел 5.4 в тексте S1 и приложении B в тексте S1). Такая последовательная параллельная эволюция к дупликации 315 Кб во всех повторностях комбинированного лечения 50-50, кроме одного, убедительно свидетельствует, следовательно, о том, что генетическая амплификация мультилекарственной оттокной помпы является адаптацией, которая придает фенотип множественной лекарственной устойчивости, который мы наблюдаем. .

Чтобы проверить более сильную гипотезу о том, что система оттока лекарств может быть ответственна за потерю синергии и переход улыбка-хмурый взгляд, мы сначала разработали системно-специфичную физико-генетическую теоретическую модель (подробно описанную в Разделе 6.4 текста S1), в котором клетки могут экспрессировать ген, продукт которого может перекачивать оба антибиотика из клетки без приспособления или затрат на АТФ. Мы предполагаем, что лекарства имеют разное сродство к насосу, и модель кодирует три фенотипа: чувствительные к лекарству клетки, которые не экспрессируют систему оттока, менее чувствительные клетки, которые это делают, а третий фенотип затем обладает дополнительным геном оттока и экспрессирует оба. Рисунок 5 показывает, что модель успешно фиксирует первые 48 часов данных, предсказывающих, что быстрая инверсия синергии, которую мы наблюдаем эмпирически, согласуется с повышением регуляции и дупликацией генов оттока.

Обобщая эту математическую схему, мы можем показать, что краткосрочная оптимальная комбинация, представленная как θ _syn , и зависящая от времени оптимальная комбинация θ _opt ( T ) в целом близки для время, которое зависит от выпуклости профиля взаимодействия лекарств (раздел 8.2 в тексте S1). Эти две величины связаны следующим образом: (3) где T — продолжительность обработки, ρ — степень расхождения между оптимальной обработкой и максимальной синергией; ρ может быть положительным или отрицательным в зависимости от того, как бактерии адаптируются к каждому лекарству.Таким образом, время (4) является приближением момента, когда оптимальным протоколом является монотерапия, а не комбинация. Все рисунки 2 (b), 3 и 5 демонстрируют это явление, но наиболее ясно его можно увидеть на рисунке 4 (c), который показывает динамический путь, выбранный лучшими и худшими методами лечения. Аналогично критическому переходу, изменение происходит через 30 часов лечения, когда терапия 50-50 заменяет монотерапию DOX как худшее лечение. Синергетическое лечение никогда не восстанавливает свой ранее благоприятный статус, скорее, как показано на Рисунке 3 (b) красным цветом, его эффективность продолжает ухудшаться в геометрической прогрессии.

Физико-генетическая модель предсказывает, что профиль взаимодействия лекарств будет устойчивым к изменениям продолжительности лечения, что можно интерпретировать как уменьшение величины ρ и, таким образом, сохранение синергии, если система оттока была подавлена ​​(Рисунок S16 в тексте). S1). Это аналогично установке μ = 0 в pbio.1001540.e001 в уравнении 1 выше.

Чтобы проверить это предсказание, мы повторили первоначальный эволюционный протокол, используя два новых штамма E. coli : штамм дикого типа AG100 и мутантный AG100A (Δ acr ) [31]; мы ссылаемся на Раздел 7 текста S1, в котором подробно описаны незначительные различия между первым и нынешним эволюционным протоколом.Последний штамм отличается от первого большой делецией в acrAB , что делает неработоспособными системы оттока, использующие продукты этого оперона, такие как acrAB-tolC . Как уже наблюдалось с использованием штамма MC4100 E. coli K12 , AG100 вскоре продемонстрировал переход улыбка-хмурый взгляд в течение 48 часов, как показано на рисунке 8 (а). Напротив, мутантный штамм AG100A (Δ acr ), в котором отсутствует acrAB , продолжал проявлять синергизм до 72 часов согласно фигуре 8 (b), что согласуется с прогнозом.

Рисунок 8. Делеция одного оперона в штамме AG100 стабилизирует синергию антибиотиков.

(a) Штамм E. coli K12 (AG100) претерпевает переход «улыбка-хмурый взгляд» в течение двух дней (значение α из α -теста показано на левом рисунке и указано ± se; день-1 α -тест в 18 ч: α > 0, df = 27, t = 14,84, p <10 ⁻¹³ с θ _opt (18 ч ) = 0.04 ± 0,01; день-2 α -тест в 18 ч: α <0, df = 27, t = −7,45, p <10 ⁻⁷ ). Правый график показывает динамику значения — α из теста α во времени с антагонизмом после синергии, где график проходит через ноль, так же, как на рисунке 4 для штамма MC4100. (b) E. coli K12 AG100A (Δ acr ) не демонстрирует перехода улыбка-хмурый взгляд на 3-й день, и тогда лекарственное взаимодействие все еще является синергическим ( α -тест через 24 часа на 3-й день: α > 0, df = 27, т ≈3.95, p <0,00052; см. раздел 7.2 в тексте S1). Правый рисунок показывает, что график - α из α -теста не проходит через ноль в любое время, поэтому лекарственное взаимодействие является стабильным и синергетическим в течение всего периода наблюдения.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540.g008

Дозозависимость: более высокие дозы усиливают переход между улыбкой и хмурым взглядом

Теперь мы спрашиваем, зависит ли наблюдаемая нами потеря синергии от выбора D ₅₀ и E ₅₀ в качестве базальных концентраций лекарственного средства.Например, можно ли было бы сохранить синергизм дольше, если бы мы увеличили дозировку обоих препаратов? Мы решаем этот вопрос с помощью следующего эксперимента.

Мы повторно запустили математическую модель для конкретного лекарства (раздел 6.4 в тексте S1) при разных дозировках и повторили эволюционный протокол, используя четыре разные пары базальных концентраций лекарства, выбранных следующим образом. По аналогии с (3) каждое новое лечение может быть представлено парой концентраций Эмпирически мы откалибровали эти четыре пары концентраций для получения 40%, 80%, 90% и 95% снижения роста по сравнению с контролем без лекарств на 18 ч в день 1 для 50-50 процедур (с θ = 1/2).Затем мы подвергли AG100 лечению каждой из четырех базальных доз в течение пяти дней с использованием пропорций препарата θ = 0,1 / 4,2 / 4,3 / 4 и 1.

Предыдущая математическая модель сделала количественный прогноз для этого нового протокола, который изображен на Рисунке 9 (а): чем больше доза антибиотика, тем больше синергизм, наблюдаемый в день 1, и тем больше результирующий антагонизм на второй день (см. Также рисунок 9 (б)). Эти цифры показывают, что модель предсказывает, что синергизм сохраняется с первого дня и далее только тогда, когда дозировки достаточно низкие.

Рис. 9. Чем сильнее синергизм на 1-й день, тем сильнее антагонизм на 2-й день как в моделях, так и в данных.

(a) Теоретическая модель, обученная ранее, предсказывает, что разница между 18-часовым синергизмом и 42-часовым антагонизмом будет больше при больших дозах. (Предыдущие данные обучения включены в одну из панелей, а базовые дозы указаны на каждой панели.) (B) Прогнозируемые изменения взаимодействия показаны синими точками, которые были определены с использованием значений α из моделирования в (a) выше. .Рядом с ними представлены аналогичные значения α из данных (c), которые черные, пунктирная линия — линейная регрессия из (c). (c) Корреляцию между синергией 1-го дня и антагонизмом 2-го дня, измеренной эмпирически при различных базальных дозах, можно увидеть в этой линейной регрессии, показывающей меру взаимодействия α через 12 часов по сравнению с α через 48 часов (см. определение α ; горизонтальные и вертикальные линии разделены). Этикетки обозначают уровень подавления роста, 40, 80, 90 и 95%, наблюдаемый через 18 ч по сравнению с нулевым контролем для каждой из четырех базальных доз лекарственного средства.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540.g009

Рисунок 9 (c) показывает, что результаты этого эксперимента количественно согласуются с моделью. Действительно, численные значения синергии первого дня и антагонизма второго дня положительно коррелируют как в модели, так и в полученных данных ( R ² = 0,990, F = 145, p <0,0069) при условии, что В первом случае доза антибиотика достаточно высока. Наконец, мы наблюдаем более быстрый отбор на устойчивость при более высоких дозах в том смысле, что чем больше доза, тем быстрее переход к антагонизму (Раздел 7.3 в тексте S1).

Обсуждение

Важно отметить, что мы, конечно, проявляем крайнюю осторожность при проведении параллелей с инфекциями in vivo , где иммунный ответ, высокоорганизованная пространственная структура хозяина, метаболизм ксенобиотиков и возникающие в результате фармакокинетики могут существенно усложняют динамику взаимодействия антибиотиков. Однако мы также утверждаем, что in vitro эволюционных исследований бактерий, связанных с общегеномным анализом и математическим моделированием, могут сыграть важную роль в выяснении того, как взаимодействия антибиотиков меняются с течением времени именно потому, что модельные системы, подобные нашей, настолько просты.

Лекарственные взаимодействия неуловимы, и синергизм может быть потерян или инвертирован по причинам, не связанным с выпуском в конкурентной среде. Синергизм должен со временем ослабевать из-за отбора аллелей лекарственной устойчивости, но он может быть инвертирован, когда лекарство разлагается с образованием метаболитов, не являющихся антибиотиками [26]. Известно, что лекарственные взаимодействия могут зависеть от гетерогенности популяции из-за дифференциальной экспрессии помпы между субпопуляциями [32], но клеточные механизмы, обычно не связанные с устойчивостью, также могут заставлять лекарственные взаимодействия меняться со временем.Например, теоретическая модель была использована, чтобы предположить [33], что синергизм и антагонизм могут быть обнаружены одновременно в популяции раковых клеток из-за метаболической адаптации в субпопуляциях, так называемый эффект Харви [34]. Насколько нам известно, эта теория не проверялась.

Существуют параллели с предыдущим исследованием [14], в котором использовались антагонистические и синергетические пары антибиотиков, чтобы показать, что синергетические среды способствуют развитию устойчивости быстрее, чем антагонистические, и аналогия их результатов в наших данных представлена ​​на рис.Их основной аргумент, что отдельные мутации устойчивости к лекарствам имеют больший эффект приспособляемости в более синергетических средах, применим к нашему исследованию и согласуется с нашими выводами. Однако, в отличие от нашего, это исследование не рассматривало, какие виды лечения приводят к наименьшей или наибольшей бактериальной нагрузке.

Рис. 10. Чем больше синергизм, тем быстрее происходит адаптация к лечению.

Это иллюстрирует совершенно ожидаемый аспект наших данных, подтверждающий предыдущий вывод [14] о различиях в скорости адаптации между курсами лечения антибиотиками с использованием разных пар препаратов: отбор на устойчивость тем больше, когда лечение более синергетично.На рисунке показано, что наши данные также подтверждают эту идею (степень взаимодействия определена в разделе «Материалы и методы»; скорость адаптации определена в разделе 4 текста S1).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540.g010

Ничего из молекулярного механизма множественной лекарственной устойчивости не закодировано в уравнении 1 pbio.1001540.e001, и, несмотря на его простоту, эта модель может объяснить другие явления. Это включает в себя ненадежность тестов на синергизм антибиотиков, таких как шахматная доска [35] — [37].Если анализ лекарственного взаимодействия проводился с резистентными клетками в инокуляте [32] или если одна из них возникла, независимо от генетического механизма, pbio.1001540.e001Equation 1 предсказывает синергию и антагонизм для двух повторов одной и той же шахматной доски [37]. Действительно, рис. 4 (c) иллюстрирует, как переход от синергетического к антагонистическому взаимодействию может происходить быстро, и только тогда, когда данные о плотности населения достаточно хорошо разрешены во времени, можно найти точку перехода от одного к другому.

Наши теоретические модели согласуются с тем, что переход улыбки-хмурого взгляда не является специфическим ни для используемых препаратов, ни для бактерий, любой механизм множественной лекарственной устойчивости, неактивный в отсутствие препаратов, который дает преимущество в пригодности в их присутствии, может быть достаточным (Раздел 8 в тексте S1). Однако, хотя наши данные подтверждают, что дупликации хромосомного оперона оттока нескольких лекарств достаточно для наблюдения перехода, это было сделано для одного вида грамотрицательных бактерий и одной пары лекарств.

Таким образом, остается много вопросов относительно общности наших наблюдений. Известно, что клинически важные патогены выводят лекарства во внеклеточное пространство или в периплазму, тем самым обеспечивая устойчивость к широкому спектру лекарств у многих видов [38], [39]. Поскольку отток наблюдался как у клинических Staphylococcus aureus [40], так и у Mycobacterium tuberculosis (TB) [41], мы спрашиваем, может ли потеря синергии или переход улыбки-хмуриться наблюдаться у других бактерий.К этому вопросу относится исследование [35] нескольких клинических изолятов чувствительного к метициллину и устойчивого к метициллину S. aureus (MSSA и MRSA), в котором комбинация ванкомицина и рифампина по-разному описывалась как синергетическая и антагонистическая. через 24 и 48 часов, при этом сообщалось о различных взаимодействиях как для разных штаммов, так и для разных концентраций лекарственного средства. Этому несоответствию не было приписано никакого механистического объяснения, и хотя это может быть совсем не связано с оттоком, истинная природа этой важной комбинации остается неясной [42].

Какие комбинации лекарств зависят от различных механизмов синергизма [43]? Дублированная область генома, показанная на фиг. 7, содержит dacA с β -лактамазной активностью [44] и три системы оттока в дополнение к acr . Отток фосмидомицина на на [45], аминогликозидов на emrE и фторхинолонов на mdlAB [39], все из которых находятся в дублированной области (таблица 2). Переход улыбка-хмурый взгляд также может иметь отношение к другим классам антибиотиков.

И будет ли переход все еще наблюдаться, если две изменяющие мишень мутации de novo потребуются для множественной лекарственной устойчивости, потому что не существовало ранее существовавшего механизма хромосомной устойчивости, который можно было бы так быстро дублировать? Нам не удалось определить пару таких мутаций, и поэтому, в качестве частичного ответа, мы сравнили продолжительность, в течение которой сохраняется синергизм, когда важный хромосомно-кодируемый мультилекарственный насос присутствует или отсутствует, используя данные с E.coli штаммов AG100 и AG100A (Δ acr ). Рисунок 8 (а) показывает, что синергизм теряется из-за антагонизма в первом штамме примерно через 35 часов, но для второго штамма взаимодействие перестает быть значительным только примерно через 72 часа, хотя значительного антагонизма после этого не наблюдается. Последний штамм без acr , следовательно, демонстрирует потерю синергизма, но перехода улыбка-хмурый взгляд не наблюдалось. Однако в этом случае взаимодействие сводится к безразличию, при котором одно из комбинированных методов лечения максимизирует плотность популяции к 4-му дню, но при этом никогда не возникает перехода улыбка-хмурый взгляд (Раздел 7.2 в тексте S1).

Было высказано предположение, что лечение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью будет более успешным, если оно будет дополнено ингибиторами эффлюксной помпы (EPI) [39], [46]. Настоящая работа предполагает, что если EPI используются в качестве адъюванта к комбинированной терапии, они могут оказаться полезными, поддерживая синергию в течение более длительного времени, хотя мы не проводили прямую проверку этой гипотезы с использованием молекулы EPI.

Мы пришли к выводу, что дополнительные теоретические подходы и in vitro согласуются с тем, что оптимальный способ комбинирования антибиотиков зависит от продолжительности лечения.Это можно было бы вывести из простого инженерного принципа, что сложными адаптивными системами нельзя оптимально управлять с помощью стратегий, постоянных во времени (раздел 8.2 в тексте S1). Последствия этого принципа для комбинаций антибиотиков драматичны и вызывают возникновение того, что выглядит как антагонизм из-за синергизма, делая предполагаемую оптимальную комбинацию худшим средством лечения в течение дня. Таким образом, хотя это аксиоматично в теории [18] и доказуемо эмпирически [14], что устойчивость к лекарственным средствам растет быстрее при более синергетических методах лечения, не уделялось внимания тому, что максимальная эффективность антибиотика может также использоваться для максимальной плотности бактерий.

Материалы и методы

Протокол эксперимента

Протокол представляет собой стандартный протокол пакетной передачи, используемый в другом месте [14] в контексте лечения антибиотиками и подробно описанный в Разделе 3 текста S1. Вкратце: бактерии культивируют в жидкой питательной среде в течение 24 ч в присутствии и в отсутствие различных антибиотиков и непрерывно встряхивают. Измерения оптической плотности производятся непрерывно, откуда можно рассчитать ингибирование, вызванное обработкой, относительно роста, наблюдаемого в контрольной культуре без лекарств.По истечении каждых 24 часов из окружающей среды отбирают пробы и примерно 1% биомассы переносят в свежую среду, которая включает в себя добавленную питательную среду и лекарства. Этот процесс повторялся в течение 5 дней.

Количественная оценка лекарственного синергизма

Существует много неэквивалентных определений синергии антибиотиков [8], [17], [47] — [49]. Чтобы обеспечить точную количественную оценку лекарственного взаимодействия, мы используем несколько последовательных показателей с разной степенью детализации, полученных с использованием аддитивности Loewe в качестве ключевого допущения.Предположим, что рост бактерий измеряется за фиксированный и короткий промежуток времени, обычно в литературе 24 часа, хотя наши измерения будут значительно дольше. Плотность популяции обозначается функцией B ( D , E ), где D и E — внеклеточные концентрации лекарственного средства, тогда число B (0,0) представляет плотность в нуле. -лекарственная среда. Предположим, что каждая базальная концентрация, D и E , нормализована для равного ингибирующего эффекта, таким образом, B ( D , 0) = B (0, E ) = rB (0, 0).Значение соответствует выбору IC ₅₀ для D и E , концентрации обозначены в тексте D ₅₀ и E ₅₀ .

Количественная оценка взаимодействия лекарств начинается с i , профиля взаимодействия, где i ( θ ) = B ( θD , (1− θ ) E ). Согласно аддитивности Loewe [8], i считается синергическим, если для всех θ между нулем и единицей исключительный эффект комбинированных препаратов превышает сумму эффектов, производимых каждым лекарством в отдельности: Это определение изображено наглядно на Рисунке 1. Рисунки 1 (b) и 1 (d) особенно актуальны.Свойство (5) обязательно выполняется, если i ( θ ) выпукло (см. Синие линии на рисунках 2 (b) и 5). Когда свойство (5) действительно выполняется, следует, что θ _syn , максимальная синергетическая пропорция лекарственного средства, которая удовлетворяет также 0 < θ _syn <1. Говорят, что антагонизм лекарств возникает, когда в (5) применяется обратное неравенство, это обязательно так, если i ( θ ) вогнутое. Взаимодействие с лекарственными средствами составляет и в этом контексте, если i ( θ ) не зависит от θ .

Плотность бактерий измеряется эмпирически в течение периода времени продолжительностью T часов, поэтому теперь мы вводим T в определение B . Обозначим плотность B (T; D , E ) и перепишем i как i ( θ , T), чтобы учесть изменение. Зависящая от времени оптимальная комбинация, θ _opt (T), тогда удовлетворяет (6) Из этого следует по определению, что θ _opt (T) и θ _syn равны, когда T = 0 и поэтому также близки при малых T, уравнение 3 описывает скорость расхождения между ними.

Если мы определим безразмерный профиль взаимодействия, то степень взаимодействия, I (T), будет дана как среднее взаимодействие, взятое для соответствующих комбинаций лекарств: Отрицательное I (T) обозначает синергию, положительное I (T) обозначает антагонизм.

Измерение выпуклости и вогнутости i ( θ , T), полученное путем аппроксимации квадратичной, можно использовать для оценки взаимодействия с лекарственными средствами. Значимая положительность (полученная с использованием t-критерия) α указывает на синергию , отрицательность указывает на антагонизм; Раздел 7 в тексте S1 дает дополнительную информацию об использовании этого теста.Если данные плотности существенно нелинейны как функция θ , что означает α ≠ 0, подобранная квадратичная диаграмма может использоваться для надежной оценки доли лекарственного средства, которая максимизирует бактериальную плотность в каждый момент времени. Эта пропорция задается одним из θ = 0,1 или — β / (2 α ) в зависимости от того, какое значение является наименьшим из q (0), q (1) или q. (- β / (2 α )). При условии, что β / (2 α ) находится между 0 и 1, приблизительную верхнюю границу доверительного интервала для этого оптимального значения можно найти с помощью t-критерия, который возвращает доверительные интервалы для α , β , и γ .На всем протяжении мы будем называть тест, описанный в этом параграфе, « α -тест», и он реализуется с использованием средств регрессии в панели инструментов статистики MATLAB.

Дополнительная информация

Текст S1.

Дополнительная информация. Этот файл включает девять разделов и два приложения: 1. Введение: ударить рано, ударить сильно? 2. Профили лекарственного взаимодействия: синергизм и антагонизм. 3. Экспериментальная эволюция в среде двух препаратов: методы.4. Экспериментальная эволюция в среде двух препаратов. 5. Анализ: полногеномное секвенирование. 6. Анализ: математическая модель, согласующаяся с данными. 7. Подтверждение теории: тестирование эксперимента «улыбка-хмурый взгляд» с нокаутом acrAB . 8. Оптимальные комбинации препаратов непостоянны: анализ. 9. Заключительный комментарий: синергия отдельных клеток и синергия популяций. Приложение A: Значения параметров. Приложение B: Гены, аннотированные в дублированных регионах.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001540.s001

(PDF)

Благодарности

Авторы выражают признательность Тобиасу Бергмиллеру, Лиз Веллингтон, Крейгу МакЛину, Габриэлю Перрону, Фрэнку Росценсвейгу, Джастину Мейеру, Алексу Холлу и Иване Гудель за полезные обсуждения. Мы благодарны за техническую поддержку Антуану Бранке, Kiel LMB / ZBM (особенно Кристиан Юнг, Гислинд Брекер, Кристоф Плиет, Аксель Шейдиг) и команде секвенирования ICMB в Киле (Маркус Шильхабель, Мелани Фрисковек, Мелани Шлапкол).Мы очень благодарны Лауре МакМарри и Стюарту Леви за предоставленные бактериальные штаммы.

Вклад авторов

Автор (ы) сделали следующие заявления о своем вкладе: Задумал и разработал эксперименты: REB HS RPM DL AFH GJ. Проведены эксперименты: DL GJ AFH RPM. Проанализированы данные: REB RPM GJ DL PR. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: REB HS PR. Написал статью: REB HS RPM GJ.

Список литературы

1. 1. Cokol M, Chua HN, Tasan M, Mutlu B, Weinstein ZB и др.(2011) Систематическое изучение синергетических пар наркотиков. Мол сист Биол 7: 544
2. 2. Баучер Х.В., Талбот Г.Х., Брэдли Дж. С., Эдвардс Дж. Э., Гилберт Д. и др. (2009) Плохие ошибки, никаких лекарств: нет ESKAPE! Новости Общества инфекционных болезней Америки. Clin Infect Dis 48: 1–12.
3. 3. Payne DJ, Gwynn MN, Holmes DJ, Pompliano L (2007) Лекарства от плохих микробов: решение проблем открытия антибактериальных средств. Nat Rev Drug Discov 6: 29–40.
4. 4. Mwangi MM, Wu SW, Zhou Y, Sieradzki K, de Lencastre H, et al.(2007) Отслеживание эволюции множественной лекарственной устойчивости in vivo у Staphylococcus aureus с помощью полногеномного секвенирования. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 9451–9456.
5. 5. Прочтите AF, Huijben S (2009) Эволюционная биология и предотвращение устойчивости к противомикробным препаратам. Evol Appl 2: 40–51.
6. 6. Эрлих П. (1913) Обращение в патологии по химиотерапии. Ланцет 445–451.
7. 7. Price CW, Randall WA (1949) Исследования комбинированного действия антибиотиков и сульфаниламидов.Am J Public Health Nations Health 39: 340–344.
8. 8. Loewe S (1953) Проблема синергизма и антагонизма комбинированных препаратов. Arzneimittelforschung 3: 285–290.
9. 9. Holm SE (1986) Взаимодействие между β -лактамом и другими антибиотиками. Rev Infect Dis 8: S305 – S314.
10. 10. Dybul M, Fauci AS, Bartlett JG, Kaplan JE, Pau AK (2002) Рекомендации по использованию антиретровирусных препаратов среди ВИЧ-инфицированных взрослых и подростков. Ann Intern Med 137: 381–433.
11. 11. Петерс Г.Дж., ван дер Вильт С.Л., ван Мурсель С.Дж., Кроэп Дж.Р., Бергман А.М. и др. (2000) Основа для эффективной комбинированной химиотерапии рака с антиметаболитами. Pharmacol Ther 87: 227–253.
12. 12. Fitzgerald JB, Schoeberl B, Nielsen UB, Sorger PK (2006) Системная биология и комбинированная терапия в поисках клинической эффективности. Nat Chem Biol 2: 458–466.
13. 13. Choi H, Lee DG (2012) Синергетический эффект антимикробного пептида ареницина-1 в сочетании с антибиотиками против патогенных бактерий.Res Microbiol 163: 479–486.
14. 14. Хегренесс М., Шореш Н., Дамиан Д., Хартл Д., Кишони Р. (2008) Ускоренная эволюция устойчивости в средах с множеством лекарственных препаратов. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 13977–13981.
15. 15. Yeh PJ, Hegreness MJ, Aiden AP, Kishony R (2009) Взаимодействие с лекарствами и эволюция устойчивости к антибиотикам. Nat Rev Microbiol 7: 460–466.
16. 16. Легар Дж., Крюгер А.С., Эйвери В., Хайльбут А.М., Йохансен Л.М. и др. (2009) Синергетические комбинации лекарственных средств имеют тенденцию улучшать терапевтически значимую селективность.Нат Биотех 27: 659–666.
17. 17. Greco WR, Bravo G, Parsons JC (1995) Поиск синергизма: критический обзор с точки зрения поверхности отклика. Pharmacol Rev 47: 331–385.
18. 18. Прочтите AF, Day T, Huijben S (2011) Эволюция лекарственной устойчивости и любопытная ортодоксальность агрессивной химиотерапии. Proc Natl Acad Sci U S A 108 ((Дополнение 2)) 10871–10877.
19. 19. Odenholt I (2001) Фармакодинамические эффекты субингибирующих концентраций антибиотиков.Int J Antimicrob Agents 17: 1–8.
20. 20. Cars O, Odenholt-Tornqvist I (1993) Субмикронный эффект постантибиотика in vitro и in vivo. J Antimicrob Chemother 31 ((Дополнение D)) 159–166.
21. 21. Mouton JW, Theuretzbacher U, Craig WA, Tulkens PM, Derendorf H, et al. (2008) Концентрация тканей: узнаем ли мы когда-нибудь? Журнал антимикробной химиотерапии 61: 235–237.
22. 22. Olofsson SK, Cars O (2007) Оптимизация воздействия лекарств для минимизации выбора устойчивости к антибиотикам.Clin Infect Dis 45 Дополнение 2: S129–36.
23. 23. Цаганос Т., Скиадас I, Кутукас П., Адамис Т., Баксеванос Н. и др. (2008) Эффективность и фармакодинамика линезолида, отдельно и в комбинации с рифампицином, в экспериментальной модели метициллин-резистентного эндокардита staphylococcus aureus . Журнал антимикробной химиотерапии 62: 381–383.
24. 24. Gullberg E, Cao S, Berg OG, Ilbäck C, Sandegren L, et al. (2011) Отбор устойчивых бактерий при очень низких концентрациях антибиотиков.PLoS Pathog 7: e1002158.
25. 25. Hastings I, D’Alessandro U (2000) Моделирование предсказуемой катастрофы: рост и распространение лекарственно-устойчивой малярии. Паразитология сегодня 16: 340–347.
26. 26. Палмер А.С., Анджелино Э., Кишони Р. (2010) Химический распад антибиотика меняет отбор на устойчивость. Nat Chem Biol 6: 244–244.
27. 27. Алексшун М.Н., Леви С.Б. (1999) Маррегулон: множественная устойчивость к антибиотикам и другим токсичным химическим веществам.Trends Microbiol 7: 410–413.
28. 28. Eicher T, Cha HJ, Seeger MA, Brandstatter L, El-Delik J, et al. (2012) Транспортировка лекарств с помощью переносчика нескольких лекарственных средств acrb включает доступ и глубокий связывающий карман, которые разделены переключающей петлей. Proc Natl Acad Sci U S A 109: 5687–5692.
29. 29. Сандегрен Л., Андерссон Д. И. (2009) Амплификация бактериального гена: последствия для эволюции устойчивости к антибиотикам. Nat Rev Microbiol 7: 578–588.
30. 30.Андерссон Д.И. (2005) Способы устойчивости бактерий к антибиотикам. Int J Risk Saf Med 17: 111–116.
31. 31. Джордж AM, Леви С.Б. (1983) Усиливаемая устойчивость к тетрациклину, хлорамфениколу и другим антибиотикам в Escherichia coli : участие не определяемого плазмидой оттока тетрациклина. J Bacteriol 155: 531–540.
32. 32. Drusano GL, Liu W, Fregeau C, Kulawy R, Louie A (2009) Разные эффекты комбинированной химиотерапии с меропенемом и тобрамицином на уничтожение клеток и подавление устойчивости Pseudomonas aeruginosa PAO1 дикого типа и его изогенного мутанта MexAB с избыточной экспрессией с помпой.Антимикробные агенты Chemother 53: 2266–2273.
33. 33. Jackson RC (1993) Комбинации амфиболических препаратов: разработка протоколов селективных антиметаболитов, основанных на кинетических свойствах мультиферментных систем. Cancer Res 53: 3998–4003.
34. 34. Harvey R (1978) Взаимодействие двух ингибиторов, которые действуют на разные ферменты метаболического пути. Дж. Теор Биол 74: 411–437.
35. 35. Байер А.С., Моррисон Дж.О. (1984) Несоответствие между методами хронометрирования и шахматной доски для определения in vitro бактерицидных взаимодействий ванкомицин плюс рифампин против метициллин-чувствительного и устойчивого Staphylococcus aureus .Антимикробные агенты Chemother 26: 220–223.
36. 36. Rand KH, Houck HJ, Brown P, Bennett D (1993) Воспроизводимость метода шахматной доски микроразбавления для синергии антибиотиков. Антимикробные агенты Chemother 37: 613–615.
37. 37. White RL, Burgess DS, Manduru M, Bosso JA (1996) Сравнение трех различных методов in vitro обнаружения синергизма: тайм-килл, шахматная доска и Е-тест. Антимикробные агенты Chemother 40: 1914–1918.
38. 38. Rice LB (2007) Новые проблемы в лечении инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями с множественной лекарственной устойчивостью.Cleve Clin J Med 74 Дополнение 4: S12–20.
39. 39. Li XZ, Nikaido H (2009) Устойчивость бактерий к лекарствам, опосредованная оттоком: обновленная информация. Наркотики 69: 1555–1623.
40. 40. Gibbons S, Udo EE (2000) Влияние резерпина, модулятора оттока нескольких лекарственных препаратов, на активность тетрациклина in vitro против клинических изолятов метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus (MRSA), обладающих tet (k) определитель. Phytother Res 14: 139–140.
41. 41. Louw GE, Warren RM, Gey van Pittius NC, Leon R, Jimenez A, et al. (2011) Рифампицин снижает чувствительность к офлоксацину у устойчивых к рифампицину Mycobacterium tuberculosis через отток. Am J Respir Crit Care Med 184: 269–276.
42. 42. Deresinski S (2009) Ванкомицин в комбинации с другими антибиотиками для лечения серьезных метициллин-резистентных инфекций Staphylococcus aureus . Clin Infect Dis 49: 1072–1079.
43. 43.Yeh P, Tschumi AI, Kishony R (2006) Функциональная классификация лекарств по свойствам их попарного взаимодействия. Нат Генет 38: 489–494.
44. 44. Sarkar SK, Chowdhury C, Ghosh AS (2010) Делеция пенициллин-связывающего белка 5 (PBP5) сенсибилизирует клеток Escherichia coli к бета-лактамным агентам.

    No related posts.